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ELISA實(shí)驗(yàn)：ELISA溫育時(shí)間、選擇、操作注意事項(xiàng)?
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加樣本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。
溫育時(shí)間：
溫育這一步是ELISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。目前市面上的商品化試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間一般為30~120分鐘，溫育時(shí)間若不夠，可能會(huì)影響測定下限。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。
在一定溫度范圍內(nèi)，溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。
溫育選擇：
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。
在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時(shí)間太長，在ELISA中一般不予采用。
溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異(“邊緣效應(yīng)"即外周孔顯色較中心孔深)?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。
若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料(如金屬等)，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個(gè)過程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。
無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說明書的要求控制溫育。
室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證時(shí)間精確，一個(gè)人一次不宜多于兩塊板同時(shí)操作、測定。
關(guān)于溫育，實(shí)際測定操作中應(yīng)注意哪些?
● 不同的溫育環(huán)境對檢測結(jié)果有影響，操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說明書控制溫育時(shí)間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。
● 為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡，不可將反應(yīng)板疊加放置，設(shè)定的溫度及時(shí)間嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，一般加入待測樣本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育。因?yàn)楹芏嗪銣叵涞臉?gòu)造，溫度及檢測的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計(jì)置于酶標(biāo)板旁，保證酶標(biāo)板旁溫度為37℃。
● 干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。
● 試劑盒一般設(shè)定的反應(yīng)溫度為 37℃，在這個(gè)溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會(huì)許多，對于全部反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷增加，這么必會(huì)致使反應(yīng)最終的OD值增加，溫育時(shí)貼封片或加蓋，避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā)。
● 試劑盒設(shè)定的一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn)，提高反應(yīng)的溫度，會(huì)加速反應(yīng)，一樣延長時(shí)間會(huì)影響反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會(huì)比試劑盒斷定的反應(yīng)程度深，也會(huì)引起陰性高值或假陽性。
實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性與實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范密不可分，未使用的試劑應(yīng)儲(chǔ)存于2-8℃，使用時(shí)應(yīng)回溫到室溫(20-25℃)。切忌不同批次的試劑混合使用，要經(jīng)常檢查酶標(biāo)儀和微量移液器的精度和準(zhǔn)備度…… ELISA看起來很簡單，但是在實(shí)際操作過程中，絕不能掉以輕心，除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作，高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證!
ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀(jì)守法，嚴(yán)于律己，寬仁以待，敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn)，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護(hù)和拓展市場，較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來。
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