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ELISA實(shí)驗(yàn)：哪些因素會(huì)導(dǎo)致ELISA實(shí)驗(yàn)的假陽性
ELISA法對(duì)IgG、IgM都有很好的檢測(cè)能力，因其靈敏度高，價(jià)格低廉，操作方便，結(jié)果客觀，在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，但在工作中遇到的zui大的問題是出現(xiàn)假陽性的問題。影響因素除了方法學(xué)、試劑盒本身之外,還有標(biāo)本處理、操作不當(dāng)?shù)榷喾N因素，雙試劑兩組結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，差異(P>0.05)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
多種因素可能會(huì)導(dǎo)致ELISA法本底偏高。出現(xiàn)灰值，除了嚴(yán)格操作、做好質(zhì)控外，對(duì)可疑假陽性的標(biāo)本一定要認(rèn)真復(fù)測(cè)。為避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)現(xiàn)將產(chǎn)生假陽性的原因分析如下：
1、內(nèi)源性因素
(1)年齡因素
老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)干擾了檢測(cè)的結(jié)果出現(xiàn)假陽性。
(2)疾病因素
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者體內(nèi)含有嗜異性抗體，自身抗體、類風(fēng)濕因子等，這些特殊成分在反應(yīng)過程中有一定的吸附作用，多為體內(nèi)某些抗原物質(zhì)干擾所致產(chǎn)生假的顯色反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性。
2、標(biāo)本因素
(1)標(biāo)本處理不chedi
血液抽出后未wan全凝固而離心分離血清不能使纖維蛋白原wan全析出，加樣后板孔中形成纖維蛋白薄膜或絮狀物，造成洗板不che底干凈，酶殘留在反應(yīng)孔中，使反應(yīng)孔吸光度值偏高，出現(xiàn)假陽性，待測(cè)血清中混有纖維蛋白原，這種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯空內(nèi)不易洗凈，試驗(yàn)表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000/min)和較長(zhǎng)的離心時(shí)間(>10/min)之上，血液標(biāo)本被充分地離心分離后，使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時(shí)避免加入這兩種干擾物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。
(2)標(biāo)本溶血
標(biāo)本溶血時(shí)細(xì)胞內(nèi)液的各種活性酶以及具有酶活性的物質(zhì)與底物非特異性結(jié)合，洗滌時(shí)不易洗去，催化底物產(chǎn)生一定的顯色反應(yīng)，使本底吸光度值偏高形成假陽性。
(3)細(xì)菌污染
標(biāo)本放置、處置不當(dāng)被細(xì)菌污染，一些細(xì)菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶會(huì)對(duì)相應(yīng)的酶做標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾，造成弱的假陽性反應(yīng)。
3、操作因素
聚苯乙烯因其具有較長(zhǎng)的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA試驗(yàn)的固相載體，聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清楚在反應(yīng)過程中，非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)，洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著試驗(yàn)的成敗，可以在加樣前離心時(shí)得以控制，BUNSEN本生試劑盒 同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌的次數(shù)和浸泡時(shí)間減輕或避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，同樣對(duì)于血液存在的非特異性的lgG的樣本很難在加樣時(shí)將其去除，那么解決的時(shí)機(jī)就是洗滌過程。
(1)加樣太快，加樣時(shí)加在孔壁上或有氣泡。
(2)底物液反復(fù)使用被污染或被強(qiáng)光照射時(shí)間過長(zhǎng)。
(3)板要平整，尤其是在洗板機(jī)洗板的過程中,往往是3排一起洗，如果板不平,就很可能造成洗液有殘留，從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。
(4)洗液溫度 實(shí)驗(yàn)表明:洗液溫度也會(huì)影響洗板的干凈程度，尤其是冬天溫度過低時(shí)容易出現(xiàn)“花板"問題，因此，需保持在室溫在20-30℃。
洗液未注滿孔，孔壁洗滌不干凈也易造成假陽性現(xiàn)象。
(5)洗液要新鮮配置，洗液要臨用前新鮮配置，放置時(shí)間過長(zhǎng)易產(chǎn)生絮狀物或渾濁，造成賭孔導(dǎo)致假陽性。
洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時(shí)間過短也會(huì)造成由于洗板不凈而造成假陽性，孵育時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)造成假陽性;由于樣本較多，加樣后未及時(shí)放入孵育箱，反應(yīng)板在室溫呆的時(shí)間過長(zhǎng)，既間接增加了孵育時(shí)間，導(dǎo)致孵育時(shí)間過長(zhǎng)。
4、儀器因素
(1)酶標(biāo)儀是垂直對(duì)反應(yīng)孔比色，反應(yīng)孔底部污染時(shí)，出現(xiàn)反應(yīng)孔吸光度值偏高。
(2)洗板拖尾現(xiàn)象，洗板機(jī)在洗板過程中，出水針出水不暢，滴滴答答不間斷出現(xiàn)水滴，造成板上水過多，拍板不干凈。
5、方法學(xué)因素
(1)廠家試劑盒，BUNSEN本生試劑盒 由于不同廠家的診斷試劑所包被的抗原配比以及抗原純度不盡一致，造成靈敏度和特異性不同，因此也造成了假陽性的產(chǎn)生。三代免疫試劑盒只檢測(cè)抗體，被某些身體不明抗原干擾，導(dǎo)致的假陽性。
(2)實(shí)驗(yàn)灰區(qū)，在陽性與陰性之間有一條明顯的分界線，作為陽性判定值(cutoff)來判定結(jié)果，一般把檢測(cè)值S/COV值在0.6-1范圍內(nèi)時(shí)作為灰區(qū)帶，因此當(dāng)1
(3)“鉤狀效應(yīng)"的產(chǎn)生，需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋重復(fù)檢測(cè)。
(4)酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)選擇，建議酶標(biāo)儀比色時(shí)選擇雙波長(zhǎng)，即敏感波長(zhǎng)(主波長(zhǎng))和非敏感干擾波長(zhǎng)(次波長(zhǎng))，zui后從儀器上得到的讀數(shù)為敏感波長(zhǎng)與非敏感干擾波長(zhǎng)之差，排除(板孔的劃痕、污跡)干擾。
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